A história total dentro do Assassin's Creed é ajustada em Setembro de 2012, onde Desmond Miles(o personagem controlado pelo jogador) foi sequestrado por uma pessoa desconhecida antes do começo do jogo, e trazido às indústrias de Abstergo, onde os investigadores estão trabalhando no projeto do Animus. O Animus pode retirar memórias do DNA do usuário, permitindo que o usuário recupere estas memórias como se ele mesmo estivesse lá. Desmond foi "escolhido" para o projeto devido ao fato de ser descendente direto de Altaïr, um membro da ordem dos assassinos durante a terceira Cruzada da Terra Santa; os investigadores expressam o interesse em compreender mais de como os assassinos trabalharam. Embora inicialmente o inconsciente de Desmond rejeite as memórias de Altaïr, ele eventualmente aprende a aceita-las e pode prosseguir seguir as ações de Altaïr com o Animus, podendo ficar cada vez mais tempo na máquina.
As memórias de Altaïr que Desmond experimenta são do começo do Ano de 1191: Ricardo Coração de Leão recapturou apenas a cidade portuária de Acre para conquistar os muçulmanos. Com uma base das operações estabelecidas, os cruzados preparam-se para marchar para o sul. O seu alvo verdadeiro é Jerusalém - que pretende recapturar para oCristianismo. Porém as forças muçulmanas estão a se reunir nas ruínas de Arsuf, pretendendo fazer um emboscada aos cruzados e impedir que alcancem Jerusalém. Quando Ricardo e Saladino combatem um com outro, os homens deixados a governar em seu lugar começam a fazer exame da vantagem de suas posições do poder.
As primeiras experiências de Desmond na memória são aquelas de Altaïr quase assassinando o grão-mestre Cavaleiros dos Templários, Robert de Sable, e recuperam o tesouro da ordem. Devido a isto, Altaïr é demovido a Uninitiated("Não-iniciado") - o Rank o mais baixo na ordem dos assassinos. Mas Al Mualim, líder dos assassinos, oferece-lhe uma oportunidade de reconquistar a sua honra. Altaïr deve arriscar-se na Terra Santa e assassinar nove homens e explorar as hostilidades criadas pela Terceira Cruzada. Ao fazer isto, estabilizaria a região, permitindo que Mualim Usher viva em uma cidade da paz(seu rank como assassino é devolvido após completar uma missão, ou seja, assassinar o alvo).
Ao longo da trama, Altaïr descobre que seus alvos são definidos mais do que apenas por um interesse compartilhado no ganho pessoal, mas está no fato de os Templários terem como objetivo a união de toda a humanidade sob uma causa comum. Paralelamente, Desmond aprende dos e-mails que lê entre as sessões no Animus, que as indústrias de Abstergo são atualmente dirigidas por Templários modernos, e que ao procurar as localizações de diversos artefatos, conhecidos como as "Pedaço do Éden", eles podem continuar lutando pelos objetivos dos Templários.
Desmond vê que foi sequestrado pela companhia, de modo que possa aprender, com as memórias de Altaïr, onde estão os outros pedaços do Éden, que podem estar enterradas em qualquer lugar do mundo. Encontra também restos da ordem dos assassinos em dias modernos, que tinham tentado recuperar antes que a informação fosse obtida pelos modernos templários.
