Assassin's Creed II começa em 1476 e termina em 1499 com o protagonista Ezio evoluindo através da história para se tornar um assassino melhor. Assassin's Creed II passa-se num mundo aberto com jogabilidade não-linear, permitindo ao jogador vaguear livremente pela cidade e comprar armas dos vendedores. Também está disponível uma tintura colorida para mudar a cor da roupa do personagem. Um artigo publicado na Game Informer revelou que Assassin's Creed II dará ao jogador a habilidade de nadar e usar os canais de Veneza como pontos de esconderijo para atrair os guardas à agua com o intuito de assassinato. Na E3 2009, foi confirmado pelo diretor criativo que Ezio será capaz de dirigir pequenos barcos. Um jovem Leonardo da Vinci está presente no jogo, como auxílio ao jogador em matéria de armas disponíveis. Em um ponto do jogo, o jogador tem acesso a máquina voadora de Da Vinci, que ele construiu.
A ScrewAttack revelou que existem muitas armas incluídas no jogo como machados, lanças, espadas, adagas, e numerosas outras. Seis armas adicionais podem ser destravadas pelos jogadores que completaram Assassin's Creed: Bloodlines ligando seu PSP ao PS3. Adicionalmente, o jogador pode desarmar oponentes e usar suas próprias armas contra eles. O jogo apresenta um sistema de combate muito mais sofisticado; o jogador pode usar uma variedade de táticas em diferentes inimigos e - como demonstrado na demo da E3 2009 - agora pode assassinar duas pessoas de uma vez através das lâminas duplas de Ezio. O jogador também é capaz de cometer um assassinato escondido se estiver posicionado corretamente em proximidade com o alvo e se Ezio permanecer anônimo sem ter de selecionar as lâminas duplas. Uma lâmina envenenada é outro update das lâminas escondidas que Ezio conseguirá de da Vinci.
Os desenvolvedores disseram que enquanto em Assassin's Creed havia cinco ou seis tipos de missão, existirão entre catorze e dezesseis tipos de missão em Assassin's Creed II. Isto faz missões grandes se juntarem. Uma missão pode começar como missão de escolta, se tornar missão de caça, e terminar como missão de assassinato. A estrutura das missões de Assassin's Creed foi jogada fora, logo não há mais investigações.
O sistema de saúde foi ajustado para se tornar mais dinâmico e participatório, significando que a "sincronização de memória" usada no primeiro jogo apenas serve para carregar a saúde até certo ponto. Ferimentos mais graves requerem uma viagem até os vários médicos, que podem trazer Ezio de volta a saúde completa.
